Gonflement complet de la résine
Peser 2,0 g de résine Wang vierge dans un tube de réaction propre et sec, ajouter 15 ml de DMF, activation à température ambiante 30 min environ.
Prenez le premier acide aminé
À température ambiante, filtrer le solvant de l’étape précédente à travers un noyau de sable et ajouter 1 mmol 5 excès molaire C Premier acide aminé à la fin, excès molaire 5 fois DMAP, excès 5 molaire DIC, DMF Do solvant réaction à température ambiante 3 h. Utiliser une fois la réaction terminée. DMF Wash 4 à 6 fois, 5 à 6 fois à chaque fois mL. Ajoutez ensuite une quantité appropriée de pyridine et d’anhydride acétique avec un rapport volumique de 1:1 et faites réagir pendant 30 min. Utiliser une fois la réaction terminée. DMF Wash 4 à 6 fois, 5 à 6 fois à chaque fois mL. (effet : bloque les micropoints actifs sur la résine vide non réactive.)
Fmoc Départ des groupes de protection
Retirer le solvant de l'étape précédente par filtration par aspiration, et ajouter 10 mL 20 % de pipéridine DMF La solution est ajoutée à la résine, N2 Remuer 10 min Enfin, filtrer la solution et ajouter 10 mL 20 % de pipéridine DMF solution, N2 Souffler et remuer 5 min Puis filtrer la solution et répéter cette opération deux fois. DMF Laver 4 fois, laver 2 fois avec du méthanol, 5 à 6 fois à chaque fois mL.
Tester l'effet d'élimination de la ninhydrine
Retirez une petite quantité de résine, lavez-la trois fois avec du méthanol, ajoutez de la ninhydrine, du KCN, une goutte de solution de phénol, 105 degrés – 110 degrés, chauffez 5 minutes, virez au bleu foncé est une réaction positive, indiquant que l'élimination est terminée et que l'étape suivante de la réaction peut être effectuée. S'il est incolore, cela signifie que le groupe protecteur n'a pas été complètement éliminé et que l'opération de déprotection ci-dessus doit être répétée.
Ensuite, le deuxième acide aminé et l'élimination du groupe Fmoc Protection
Peser 3 fois l'excès molaire C Le deuxième acide aminé à la fin, un excès molaire 3 fois de HBTU et un excès molaire 3 fois de HOBT Dans le tube de réaction, ajouter la quantité appropriée de DMF Une fois la solution complètement dissoute, ajouter un excès molaire 10 fois (pur) de DIEA, réaction à température ambiante 40 min, utiliser DMF Wash 4 à 6 fois, 5 à 6 fois à chaque fois mL. Prenez une petite quantité de résine et testez avec le réactif de détection de ninhydrine et elle apparaîtra incolore, puis ajoutez 10 ml de solution de pipéridine DMF pour éliminer Fmoc, faites-le deux fois pendant 10 min, 5 min, après utilisation du DMF, lavez 4 fois, lavez 2 fois avec du méthanol, 5 à 6 fois à chaque fois ml. Retirez une petite quantité de résine et utilisez le réactif de détection de ninhydrine pour la détecter. Si la détection est bleue, vous pouvez passer à l'étape suivante de la réaction.
Par analogie, répétez les étapes 2.6 jusqu'à ce que la synthèse soit N. Retirez le dernier acide aminé en fin de base Fmoc Protect, puis égouttez.
Excrétion de résine et séparation et détection de produits purs
Enfin, utilisez une solution de coupe d’acide trifluoroacétique (95 % TFA : 2 % TIS : 2 % EDT : 1 % H2O). Coupez 2 h, filtrez la solution réactionnelle par aspiration et obtenez une solution d’acide trifluoroacétique du polypeptide. Sécher le lysat avec de l'azote autant que possible, précipiter avec de l'éther, centrifuger, puis laver avec de l'éther pendant 3 secondes. Environ 5 fois, un solide blanc a été obtenu. Après l'avoir dissous dans de l'eau pure, dessaler et purifier par HPLC, lyophiliser et précipiter les cristaux, prélever une petite quantité d'analyse MS.